又双叒叕发文章啦|安诺单细胞转录组测序助力解析调控卵母细胞成熟的分子机制

来源: 安诺基因   2020-1-16   访问量:1168评论(0)

众所周知,正常情况下人体的内分泌系统中各种激素相互协调,共同维持体内平衡,但由于某种原因打破这种平衡时,则会引发异常的激素变化。相比于男性而言,女性的身体对体内激素变化更为敏感,严重时易出现月经不调,进而影响排卵周期(通常涉及卵母细胞的成熟),甚至可导致女性不孕。因此,了解激素如何影响卵母细胞的成熟是女性不孕研究中必不可少的一步。

2019年12月16日,中国农业大学夏国良教授和王超副教授研究团队在Nature Communications(IF:11.878)上发表了名为“HDAC3 maintains oocyte meiosis arrest by repressing amphiregulin expression before the LH surge”的研究论文,本研究发现在LH(促黄体生成素)峰形成前,HDAC3(组蛋白去乙酰化酶)通过H3K14去乙酰化来抑制AREG(双调蛋白)表达,从而负调控卵母细胞成熟。通过使用HDAC3抑制剂,可以改善小鼠卵母细胞的成熟和发育能力,进而推测HDAC3可能是提高体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点,这为进一步解析女性不孕相关研究提供了新的见解,安诺基因在本研究中有幸承担scRNA-seq和RNA-seq相关工作


研究思路

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主要研究结果

1. HDAC3负调控卵母细胞成熟

本研究分析了在促性腺激素诱导的小鼠卵泡生长过程中所有I类HDACs的表达模式,发现HDAC3是GCs(颗粒细胞)中仅有的在体内外均被FSH(促卵泡激素)上调且被LH下调的HDAC,这表明其在卵母细胞成熟过程中对促性腺激素诱导的反应中起关键作用。通过小鼠模型实验证明在LH峰形成前,Hdac3的删除会导致卵母细胞提前成熟。结合增殖细胞核染色实验发现卵巢GCs中HDAC3的耗竭可能终止卵巢GC增殖,这与LH对卵母细胞成熟和GC增殖的影响相似。

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图1 HDAC3负调控卵母细胞成熟


2. LH峰形成前HDAC3抑制GCs中AREG的表达

通过体内诱导实验(孕马血清促性腺激素,PMSG)、体外抑制剂实验(HDAC1/3抑制剂HDACi 4b和EGFR抑制剂)和ChIP分析发现,HDAC3可在LH峰形成前特异性结合Areg启动子区域,负调控AREG表达,而且HDAC3的缺乏可调节cGMP(细胞周期蛋白GMP)水平来诱导卵母细胞成熟。利用HX-M199和M199培养基培养卵母细胞,发现HDACi 4b对卵母细胞减数分裂成熟无直接影响。选取有/无HDACi 4b抑制剂培养的成熟卵母细胞进行scRNA-seq,结果显示HDACi 4b不影响卵母细胞的发育能力。结合小鼠模型实验中的Hdac3flox/floxHdac3cKO卵巢的RNA-seq数据,进一步挖掘受HDAC3调节的其他与卵母细胞成熟相关的因素。

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图2 HDAC3抑制GCs中AREG的表达


3. H3K14ac介导HDAC3和LH作用于Areg表达

通过体内体外LH/hCG(人体绒毛膜促性腺激素)诱导实验和ChIP分析,发现H3K14ac可介导LH / hCG作用于靶基因表达。HDAC3敲除实验和HDACi 4b抑制剂实验结果表明,H3K14ac是LH和HDAC3调控AREG表达的关键。同时这些实验证实在LH诱导前,HDAC3可降低体内体外H3K14ac水平。

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图3 H3K14ac介导HDAC3和LH作用于Areg表达


4. FOXO1可将HDAC3募集到
Areg启动子区

通过Co-IP-MS实验鉴定出结合HDAC3抑制Areg表达的因子,其分别为NCoR复合体的核心成员NCoR1、NCoR2和TBL1X。DNA pulldown联用MS分析和JASPAR数据库注释,鉴定出四个候选转录因子,即SP1、FOXO1、GATA4和Myod1。对它们进行HDAC3 Co-IP实验,结果发现它们可能与HDAC3-NCoR复合体相互作用,而不是直接与HDAC3相互作用。通过交联Co-IP-MS和Western Blotting实验证明FOXO1、GATA4和Myod1可能在Areg启动子处与HDAC3复合物相互作用。交联逆转Co-IP-MS和Western Blotting实验证明FOXO1与HDAC3之间的相互作用。综上,在LH峰形成前,HDAC3可能被FOXO1、GATA4和Myod1中的一个或多个转录因子募集到Areg启动子区。

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图4 FOXO1可将HDAC3募集到Areg启动子区


5. HDAC3和LH通过调节SP1募集到Areg启动子而影响Areg表达

已知组蛋白乙酰化是通过使染色质展开和增加转录因子的进入来诱导基因表达,因此,需要鉴定去除HDAC3后与Areg启动子结合的转录因子。通过HDAC3抑制实验、Hdac3敲除实验和ChIP分析,发现SP1参与了HDAC3下调后的Areg转录,同时HDAC3的丢失和H3K14的乙酰化促进了SP1与Areg启动子的结合。SP1抑制实验(SP1抑制剂光辉霉素A)、Western Blotting和ChIP分析结果表明LH诱导H3K14ac并加速SP1进入Areg启动子区。

 

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5 HDAC3和LH通过调节SP1募集到Areg启动子而影响Areg表达

 

6. HDAC3抑制剂改善了小鼠卵母细胞的成熟和发育能力

根据上述实验,本研究证实了通过抑制GC来源的HDAC3可诱导不依赖于LH的卵母细胞成熟。利用HDACi 4b进行小鼠卵母细胞体外培养,证明其促进了卵母细胞GV阶段向MII阶段的转变。结合体外受精和胚胎移植实验发现HDACi 4b组可以正常受孕,其产生的幼崽数量与体重和对照组相似。同时发现HDAC3是提高不依赖LH的体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点。

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图6 HDAC3抑制剂改善了小鼠卵母细胞的成熟和发育能力


文章小结

本研究通过RNA-seq、scRNA-seq和生理生化实验解析了调控卵母细胞成熟的分子机制,并发现HDAC3可能是提高体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点,这有助于医生对女性不孕相关疾病进行精准诊断和精准治疗。

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图7 安诺单细胞测序技术总览


作为国内单细胞测序技术整体解决方案的提供商,目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品,覆盖三大组学(基因组、转录组、表观组),拥有丰富的项目经验、合作单位100+物种经验50+、多篇高分文章IF累计100+,能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略,使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。


 

参考文献:

Wang, H., Cai, H., Wang, X. et al. HDAC3 maintains oocyte meiosis arrest by repressing amphiregulin expression before the LH surge[J]. Nat. Commun., 2019,10: 5719. doi:10.1038/s41467-019-13671-8




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