Dux-KO和WT小鼠的Dux基因簇分布

利用三代重测序技术对Dux-KO小鼠的基因型进行进一步确认，发现了LOC100504180（Duxf1）、Dux（Duxf3）和Gm4981（Duxf4）的大片段缺失，以及Gm10807（Duxf2）、Gm9919（Duxf5）的短片段缺失，体现了PacBio长读长测序在检测大片段结构变异方面的优势。

Dux缺失导致产仔数量的显著减少

3. 为进一步验证Dux缺失在胚胎中的影响，研究人员采集了Dux-KO和WT个体在多个时期的胚胎，包含受精卵和早中晚期的2C（二细胞）胚胎，进行单细胞转录组（Smart-seq2）分析。Dux仅在早期2C阶段短暂表达，通过对比Dux-KO和WT胚胎在2C阶段各个时期ZGA相关基因的表达，发现在Dux缺失的条件下ZGA过程仍然可以被激活，但发生的时机被推迟（下图d-e）。

WT与Dux-KO胚胎在2C阶段基因表达情况比较

MERVL通常在受精卵阶段就能被检测到，早于Dux的表达，它可以与一些2C基因生成嵌合转录本，促进附近的2C基因表达。在Dux-KO胚胎中发现MERVL在2C阶段的中晚期显著上调（上图f），这与ZGA关联基因的激活显著相关，表明Dux是通过增强而不是直接激活来调控ZGA转录本的表达。

Dux在胚胎中的延长表达导致早期胚胎的发育受阻

5. 无论内源还是外源的Dux表达均在胚胎中仅持续了数个小时，尤其当Dux mRNA被注射到受精卵中后，Dux-EGFP在3-5h内剧烈降解，且对胚胎发育未产生影响（下图a-c）。这也进一步表明了Dux的降解对胚胎发育的重要影响。蛋白酶抑制剂MG132的使用大大延迟了受精卵中Dux-EGFP信号的衰减，使得发育受阻（下图d）。此外，Dux-EGFP在NIH3T3细胞系中的过表达也揭示了Dux不仅与ZGA相关蛋白相互作用，也和泛素途径相关蛋白发生相互作用（下图e）。

外源Dux-EGFP在受精卵中剧烈降解

综上，本项研究表明了Dux通过增强而不是直接激活ZGA来调控早期胚胎的发育过程。尽管Dux敲除小鼠可以存活至成年，但Dux的缺失会推迟ZGA过程并降低胚胎发育的潜能。此外，Dux在2C阶段早期短暂表达后，会在DNA水平被沉默并在RNA与蛋白水平被降解，长期激活会严重损害早期胚胎的发育。