涨知识!对于PCR你真的知道么?

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2019-10-14   访问量:1057评论(0)

 

涨知识!对于PCR你真的知道么?

 

PCR技术作为分子生物学最基础的研究方法之一。20世纪80年代凯利·穆利斯发明第一代PCR技术以来,“变性、退火、延伸”三部曲从未停歇。历经三十多年的演变,PCR技术衍生出众多变体小翊总结了一代PCR的一些常见类型,助力您的科学研究。

常规PCR

常规PCR一般是由Taq DNA聚合酶介导的PCR反应,操作较为简便,产物带有A尾。通过琼脂糖凝胶电泳对终产物进行定性和半定量分析。兼容样本范围广,但保真性低,主要应用于常规重组质粒验证和基因型鉴定等方面。

常规PCR产品

产品名2×Hieff® Robust PCR Master Mix (With Dye)

产品特点:

1)延伸速度快(15-30s/kb),极限速度达5s/kb。

2)模板适用性更广泛,靶基因GC耐受范围35-70%。

图1. 以小鼠基因组为模板,分别扩增1-4kb的片段。

高保真PCR

高保真PCR一般是由保真性较高的DNA聚合酶介导的PCR反应。第一代高保真DNA聚合酶是从栖热原始菌Pyrococcus furiosus中获得的具有校正功能的pfu酶,与常规Taq酶相比多了一种3-5的核酸外切酶活性(Proofreading活性),保真性大大提高且扩增的产物通常为平末端。目前主要有2类产品:一类是混合型的高保真酶,将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶混合用于提高扩增效率;另一类是单一型的高保真酶,保真性更高。

翊圣Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶基于Pfu,经基因工程改造而成。酶溶液中添加了独特的反应增强因子、热启动因子和延伸因子,极大提高了扩增的成功率,特异性和延伸速度。对于高保真PCR应用而言,具有高保真性、高成功率、高特异性的Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶是理想选择。

高保真PCR产品

产品名:Hieff Canace® Gold PCR Master Mix

产品特点:

1)保真性高,是Taq酶的52倍,pfu酶的6倍。

2)超高特异性。

3)高灵敏:可扩增低至1 pg模板。

图2. 5种品牌的高保真DNA聚合酶扩增2 kb,4 kb的小鼠gDNA。Y:Hieff Canace® Gold高保真DNA聚合酶;A-E:其他品牌的高保真DNA聚合酶。

热启动PCR

热启动PCR,也称Hotstart PCR。指通过一定条件将DNA聚合酶与其他PCR反应物隔绝,使其低温条件下无活性,高温加热后释放酶活,进而避免出现非特异性产物。热启动PCR的关键是热启动型的DNA聚合酶,一般通过抗体、配体或化学修饰等来封闭酶活性中心,不同的热启动修饰方法原理上有所区别,各有优劣势见下表。通常应用于复杂模板、低拷贝基因扩增,也是IVD试剂的核心原料。

酶活封闭类型

化学修饰

配体修饰

抗体修饰

原理

低温下,化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合,酶无活性;升温至变性温度,两者脱离,酶活性中心暴露发生聚合反应。

核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合,进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。

高温变性前,抗Taq抗体与Taq酶结合,抑制聚合酶活性温度升高至变性温度,抗Taq抗体变性失活,聚合酶发生聚合反应。

优点

酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染性价比高。

激活时间短,保证酶活。

酶激活时间短保证酶活,亲和力强灵敏度高。

缺点

酶激活时间较长可能会影响酶的活性,导致PCR产物的产量降低。

核酸配体是一种可逆抑制剂,不如化学修饰法稳定,特异不够强

抗体修饰是一种动态平衡不如化学修饰法稳定,价格更贵。

热启动PCR产品

产品名Hieff UNICON® HotStart Taq DNA Polymerase (抗体法热启动Taq酶)

产品特点:抗体法修饰,亲和力强,灵敏度高,特异性好。

直扩PCR

直扩PCR技术,是以未经基因组纯化的微量原始样本或其裂解产物作为模板进行PCR反应。广泛适用于血液样本、植物和动物等组织,与常规PCR相比,样本用量少、操作简单、实验成本低、可高通量化操作。可应用于基因分型、转基因鉴定等实验。

翊圣直扩PCR系列产品运用独特的裂解体系,快速裂解样品,裂解液可直接作为模板,搭配试剂盒中的具有超强抑制物耐受性的Taq DNA聚合酶进行基因的高效扩增。

3.组织直扩系列流程图

小鼠直扩PCR产品

产品名:Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠组织直接PCR试剂盒(Cat#10185)

产品特点:

1)样本需要量少:5mg鼠组织或1-5mm鼠尾。

2)模板制备更方便:无需研磨,无需精提纯化gDNA。

3)优化的PCR体系:具有更高的特异性、更强的 PCR 反应抑制物耐受性。

图4.适合不同类型的小鼠粗提组织

多重PCR

多重PCR,也称复合PCR。反应原理、反应过程与常规PCR无异,需要在同一个PCR反应体系中,使用多对引物对多个基因同时进行扩增。理论上只要PCR扩增的条件合适,引物对的数量可以不限,但实际由于各种条件的限制,实际能够扩增的产物有限。多重PCR反应体系的组成和PCR循环的条件需经过优化以确保同时扩增多个片段。具有高效性、系统性、经济简便性,难点是反应体系各组分的平衡。主要用于多种病原微生物的同时检测或癌基因的分型。

图5.多重PCR原理图

多重PCR产品

产品名:Hieff® Multiplex PCR Kit

产品特点:

1)扩增子大小:适合50bp-1.5kb的扩增子。

2)均一性好:靶点偏好性极低。

3)特异性强:最大程度抑制非特异性扩增;

4)灵敏度高:可扩增低至1ng模板;

5)扩增重数:可达20-1000重。

图6. 以人gDNA模板,进行10重PCR,可检测低至1ng的模板

巢式PCR

巢式PCR是指利用两对引物进行两轮PCR扩增的反应。首先使用目的片段外围的引物对模板进行扩增,然后使用内部的巢式引物同时将第一轮PCR扩增产物作为第二轮扩增的模板。第二次PCR扩增得到的目的片断短于第一次扩增。

翊圣GMyc-PCR 支原体检测试剂盒基于支原体16S-23S rRNA序列保守区域利用巢式PCR法原理可精确检测到常见的支原体污染。主要应用于病毒检测、测序分析、低表达基因检测等。

巢式PCR产品

产品名:GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原体检测试剂盒

产品特点:检测多种支原体类型,检测限低至单拷贝。

7. 巢式PCR扩增含不同浓度支原体样品。

降落PCR

降落PCR,又称Touch-down PCR。通过设置PCR程序中的退火温度,一般开始时高于预设的Tm值,随着反应的进行,退火温度逐渐降低到Tm值,并最终低于该温度进行PCR反应。通过反应程序中退火温度的设置,极大程度上降低了引物与模板的非特异性结合。主要用于PCR反应程序的优化,提高产物特异性。

常见的PCR类型介绍就到这里了。当然,除了上述介绍的PCR形式,还有锚定PCR、原位PCR等不同的PCR类型,如感兴趣可自行查阅或留言哦!

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产品类别

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

促销价(元)

常规PCR

2×Hieff® Robust PCR Master Mix (With Dye)

10106ES03

1ml

65

买30支送30支 买50支送70支 买100支送200支 买300支送800支

高保真PCR

2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix高保真酶预混液

10149ES01

1ml/5ml

553/1453

1-3支,144/支 4-6支,128元/支 7-10支,120元/支;11支以上,112元/支

热启动PCR

2×Hieff™ HotStart PCR Genotyping Master Mix (With Dye)

10108ES03

1ml

75

30支送30 50支送70 100支送200 300支送800

2×Hieff UNICON® HotStart PCR Master Mix (With Dye)

10111ES03

1ml

96

77

直扩PCR

Mouse Tissue Direct PCR Kit (With Dye) 小鼠组织直接PCR试剂盒

10185ES50/70

50/200T

323/983

买一送一

多重PCR

Hieff Multiplex PCR kit

13279ES50

100T/500T

875/3165

875/3165

巢式PCR

GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit GMyc-PCR支原体检测试剂盒

40601ES10/20

10T/20T

327/557

327/557



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